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AxyPrep 質(zhì)粒大量試劑盒
本試劑盒采用改進(jìn)的SDS 堿裂解法，結(jié)合DNA 制備膜選擇性地吸附DNA 的方法達(dá)到快速純化質(zhì)粒DNA 的目的。適合于從120-300 ml 細(xì)菌培養(yǎng)物中提取多至500 μg 高純的質(zhì)粒DNA，用于測序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性內(nèi)切酶消化、細(xì)菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
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本試劑盒采用改進(jìn)的SDS 堿裂解法，結(jié)合DNA 制備膜選擇性地吸附DNA 的方法達(dá)到快速純化質(zhì)粒DNA 的目的。適合于從120-300 ml 細(xì)菌培養(yǎng)物中提取多至500 μg 高純的質(zhì)粒DNA，用于測序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性內(nèi)切酶消化、細(xì)菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
一、試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性
說明書，耗材：大量DNA制備管、大量濾器。
RNase A：50 mg/ml，室溫密閉貯存
Buffer S1：細(xì)菌懸浮液，加入RNase A 后，混合均勻，4°C貯存。
Buffer S2：細(xì)菌裂解液（含SDS/NaOH）；若出現(xiàn)沉淀，應(yīng)于37°C溫浴溶解并冷卻至室溫后再室溫密閉貯存。
Buffer S3K：中和液，室溫密閉貯存。
Buffer B：DNA結(jié)合溶液，室溫密閉貯存。
Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存。
Buffer W2 concentrate：去鹽液。使用前，根據(jù)瓶上數(shù)量加入乙醇，混合均勻，室溫密閉用100%乙醇或95%乙醇。
Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5。室溫密閉貯存。
二、注意事項(xiàng)
1. 細(xì)菌過量將影響溶菌及質(zhì)粒DNA的釋放。
2. 在步驟3和步驟4中操作必須溫和。劇烈搖晃，將導(dǎo)致基因組DNA的污染。但混合必須充分，否則影響得率。
3. 在加入Buffer S3K時(shí)，蛋白質(zhì)和基因組DNA形成粘稠的白色絮狀沉淀，必須充分混合均勻，使凝集塊中間也得到充分中和凝結(jié)。
4. 將洗脫液或水加熱至65°C，有利于提高洗脫效率。
5. DNA分子呈酸性，建議在2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5洗脫液中保存。
三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1. 第一次使用時(shí)，在Buffer W2 concentrate 中按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇。
2. 準(zhǔn)備無核酸和核酸酶污染的Tip 頭、離心管。
3. 4°C預(yù)冷的Buffer S3K和Buffer B。
四、操作步驟
第一次使用時(shí)，將RNase A 全部加入Buffer S1 中，混合均勻，4°C 保存。
1. 取120 ml 在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的高拷貝數(shù)質(zhì)粒菌液，或250 ml 過夜培養(yǎng)的低拷貝質(zhì)粒/Cosmid菌液（若使用豐富培養(yǎng)基，菌液體積應(yīng)減半或更少），≥3,000×g 離心10 min，棄上清。將離心管倒置于紙巾上數(shù)分鐘，除盡上清。
2. 用10 ml 已加入RNase A 的Buffer S1 懸浮細(xì)菌沉淀，懸浮需均勻，不應(yīng)留有小的菌塊。
3. 加10 ml Buffer S2，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)8-10 次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液；此步驟不宜超過5 min。
4. 加入10 ml 4°C 預(yù)冷的Buffer S3K，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)10-12 次混合均勻，直至形成緊實(shí)的凝集塊；室溫放置5 min。
5. 加入10 ml 4°C 預(yù)冷的Buffer B，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)10-12 次混合均勻；10,000×g 離心（4°C）10 min。
6. 正確連接負(fù)壓裝置，將大量DNA 制備管插到負(fù)壓裝置的插口上。
7. 吸取步驟5 中的混合液，轉(zhuǎn)移到大量濾器中，插入注射器芯，垂直向下緩慢推注至大量DNA 制備管中，開啟并調(diào)節(jié)負(fù)壓至-25-30 英寸汞柱，緩慢吸盡管中溶液。
8. 保持負(fù)壓，加12 ml Buffer W1，吸盡管中溶液。
9. 加14 ml Buffer W2，吸盡管中溶液。
* 確認(rèn)在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的指定體積加入無水乙醇。
10. 將大量DNA 制備管置于50 ml 離心管中，加4 ml Buffer W2 溶液，≥6,000×g 離心5 min。
* 可選步驟：將大量制備管插到負(fù)壓裝置的插口上，最大負(fù)壓吸引10 min 以確保除盡殘留的Buffer W2。
11. 將大量DNA 制備管置于潔凈的50 ml 離心管中，在DNA 制備管的基質(zhì)上加1.5 ml 水或Eluent，室溫靜置5 min?！?,000×g 離心5 min 收集質(zhì)粒DNA。
12. 可選步驟：同樣方法，在DNA 制備管的基質(zhì)上加0.75 ml 水或Eluent，室溫靜置1 min?！?,000×g 離心5 min 收集質(zhì)粒DNA。